脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染法的經(jīng)驗(yàn)分享

 　　脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染法的經(jīng)驗(yàn)分享：

　　1、轉(zhuǎn)染前1天將0.5～2×105細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，并加入500ul不含抗生素的*培養(yǎng)基，以保證轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合達(dá)90～95%。

　　2、準(zhǔn)備復(fù)合物

　　(1) 將0.8ug DNA稀釋于50ul無血清無抗生素的培養(yǎng)液中輕輕渾勻。

　　(2) 將2ul Lipofectamine2000稀釋于50ul無血清無抗生素的培養(yǎng)液中，輕輕渾勻，室溫孵育5分。注意：必須在25分內(nèi)進(jìn)行。

　　(3) 5分后將它們混合，并輕輕渾勻，室溫孵育20分。

　　3、吸去培養(yǎng)板的培養(yǎng)基，用PBS或無血清培養(yǎng)基()清洗細(xì)胞2次。

　　4、將復(fù)合物(總體積100ul)加入培養(yǎng)孔，前后搖動培養(yǎng)板使其分布均勻。

　　5、將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱孵育4～6h后，可以更換含血清培養(yǎng)液去除復(fù)合物(也可不用)。

　　6、24～48h后可以觀察轉(zhuǎn)入基因表達(dá)情況。

　　7、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：換含血清培養(yǎng)基24h后將細(xì)胞以1：10(或更高比例)傳代，1天后更換篩選培養(yǎng)基篩選。

　　8、優(yōu)化：要保證細(xì)胞匯合率達(dá)90～95%(比較高);DNA/ Lipofectamine2000比率1：0.5～1：5，一般細(xì)胞1：2～3.

　　脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染法的主要優(yōu)點(diǎn)是可用將DNA轉(zhuǎn)染至懸浮或者鐵壁細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染效率相對較高、對基因片段大小的限制較小等，但是

　　陽離子脂質(zhì)體2000對細(xì)胞的毒性相對較高，為了防止其毒性，要摸索好如下實(shí)驗(yàn)條件：脂質(zhì)體2000與質(zhì)粒的比例、細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)間等。